Principe de l'épifluorescence

Un premier problème provient des longueurs d'onde de la source d'excitation qui doivent toujours être courtes si l'on veut utiliser des substances qui fluorescent dans le visible. L'utilisation de sources fournissant une importante quantité de bleu, de violet et même très souvent d'ultraviolet est donc requise. Il faut alors généralement remplacer la simple lampe à incandescence (lampe halogène) de l'éclairage Köhler par un ‘brûleur' au Xénon ou un ‘brûleur' HBO à vapeur de mercure. De surcroît, ces courtes longueurs d'onde imposent l'usage d'optiques en matériaux spéciaux tels la fluorine ou le quartz, les verres optiques standard absorbant fortement dans ce domaine spectral, la plupart étant même opaque dans l'ultraviolet. Tous les constructeurs proposent de telles optiques incorporant des éléments en fluorine, matériau qui permet par ailleurs d'améliorer la correction chromatique des objectifs en raison de sa dispersion très faible. Certains constructeurs proposent en plus des objectifs faits avec des matériaux de très grande pureté n'ayant aucune fluorescence propre qui pourrait voiler les images.

Le second et principal problème de la détection de la fluorescence des objets microscopiques provient du très faible rendement énergétique de ce mécanisme de conversion de longueur d'onde de flux lumineux. Les flux que l'on veut détecter sont extrêmement faibles alors même que l'éclairement, et sa diffusion standard par la préparation, sont violents. Pour rendre l'observation possible il faut amener le rapport signal sur bruit à un niveau acceptable. Pour cela on met usuellement à profit la séparation spectrale de l'excitation et du signal utile qu'il est donc possible de séparer par des filtrages appropriés.

Une méthode permettant de surmonter les difficultés précédemment évoquées est dénommée épifluo­rescence : la préparation est éclairée par le dessus avec un illuminateur épiscopique et l'observation de la fluo­res­cence est effectuée dans une configuration de type microscopie par réflexion.

Un des avantages de ce “rétro-éclairage” provient du fait que les préparations observées sont usuellement plus transparentes que réfléchissantes. La lumière d'excita­tion réfléchie et rétro-diffusée, qui forme ici le flux lumineux parasite à éliminer, est donc nettement plus faible que la lumière transmise et diffusée vers l'avant qui formerait le flux parasite dans une configuration d'éclairage en ligne. Comme l'émission par fluorescence est un phénomène usuellement isotrope, le signal utile ne dépend pas du sens de l'éclairage, et le rapport signal sur bruit est donc nettement meilleur en épiscopie. Cet avantage est encore renforcé si l'on prend en compte la traversée de la préparation. Dans un cas, l'excitation ne doit traverser que la lamelle couvre objet (0,17 mm), qui peut fort utilement être en quartz (ou même absente) si l'on travaille avec de l'UV, alors que dans l'autre cas elle doit traverser la lame porte objet (~1 mm) quasiment toujours en verre.

Un deuxième avantage de la configuration épiscopique réside dans la possibilité de réaliser un filtrage spectral efficace de l'excitation et du signal utile au niveau du bloc illuminateur. Pour travailler en épifluorescence on remplace la lame semi-réfléchissante de l'éclairage Köhler par réflexion (revoir Fig.6 ou 23) par un “cube” constitué de deux filtres et d'un miroir dichroïque dont le schéma est donné sur Fig.28.

Le filtre d'excitation sélectionne dans le flux lumineux issu de la source les seules longueurs d'onde appropriées à l'excitation de la fluorescence de l'échantillon. Le miroir dichroïque réfléchit les courtes longueurs correspondant à l'excitation et transmet les plus grandes longueurs d'onde. Il renforce donc dans un premier temps l'effet du filtre d'excitation. La lumière issue de l'échantillon, qui contient la lumière de fluorescence et la lumière parasite de rétro-diffusion de l'excitation, frappe le miroir dichroïque. La fluorescence est transmise avec très peu de pertes alors que la majeure partie de la lumière parasite est réfléchie. Le faisceau lumineux atteint ensuite le filtre d'arrêt qui, par définition, bloque la lumière d'excitation parasite résiduelle et laisse passer la fluorescence. Avec des filtres et des miroirs de grande qualité, cette disposition permet d'obtenir d'excellents résultats avec une mise en œuvre très simple et très sûre pour l'utilisateur. Les constructeurs proposent en général de très nombreuses combinaisons de filtres et de miroirs dichroïques adaptées aux substances et fluorochromes couramment utilisés.

L'épifluorescence possède également l'avantage de permettre l'utilisation conjointe de la lumière transmise. Les images obtenues en fluorescence sont en effet généralement constituées de petites zones émissives disséminées dans un champ sombre et il est dans ces conditions très difficile d'identifier les objets à l'origine de la fluorescence. Il est dès lors très utile de pouvoir simultanément observer la préparation en diascopie. Ceci ne pose aucun problème pratique sur les microscopes récents disposant de deux blocs d'illumination séparés, l'un diascopique et l'autre épiscopique, dont on peut séparément régler la puissance. Il est de surcroît usuel d'utiliser la voie diascopique en contraste de phase pour améliorer la visualisation et l'identification des objets.